自1972年美国斯坦福大学生物学家伯格首次将两个物种——SV40病毒与λ噬箘体——的DNA结合得到重组DNA分子以来，控制基因创造生命就从一种理想演变成为现实。三十多年来，虽然在人们记忆中留下印记的大事并不多，诸如克隆羊多莉来了又走了，以及延续至今的转基因生物之争等，但基因工程技术不仅将生物学研究推进到分子时代，且其众多成果事实上早已深深地渗透到我们的经济、农业、医疗以及日常生活之中。而生物医学科学家们依然在此基础上，进一步深入探索生命的奥妙，并力图破解癌症、老年痴呆症等一系列困扰人类健康的重大疾病。今天生物科学中不可或缺的基因工程技术，所依赖的最重要的一种工具，是被称为限制性核酸内切酶的一大类蛋白质。
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。在基因工程中用得最多也最为广泛的是Ⅱ型限制性核酸内切酶，它们能识别4～8个核苷酸组成的特定核苷酸序列，并且从识别序列内精确地切割DNA分子。最为特别的是，识别序列都具有二元旋转对称的结构形式（称为回文结构），而内切酶在切断它们时往往会留下单链突出的尾巴。我们知道，DNA分子双链结构是严格互补的，因此，当用同一种限制性核酸内切酶切两条DNA分子时，得到的片断可以完全匹配地交叉重新连接在一起。所以人们又把这种限制性内切酶称为“分子剪刀”。
也许你会认为，在基因工程中占据如此重要位置的限制性核酸内切酶，在科学上定是很多人追逐的对象，科学家们都争先恐后地力图使自己成为发现者。这种想法无可非议，也是很多教科书喜欢使用的写作手法。毕竟人们早已有基因工程的念头，试图人为操纵基因的组合，于是经过艰辛的工作，终于找到了合适的工具。这样的叙事方式看起来条理分明，逻辑清晰。然而纵观生物科学史，多数重大的科学发现并非如此而来，而常常如飓风起于萍末般，从一些看似不起眼的现象着手，获得对自然对生命更加深刻的认识，甚至开创一个崭新的领域，打开一片新天地。而限制性核酸内切酶的发现史，正是一个范例。不妨让我们一起回到限制性核酸内切酶发现的时代，追随先行者的足迹，回顾它的发现历程。
老虎机与破碎的试管
限制酶发现的时代大背景是20世纪四五十年代，那个遗传物质究竟是核酸还是蛋白质之争如火如荼的时代，也是生物学史上最激动人心的时代之一。当时，诸多物理学研究领域的科学家在波尔、德尔布吕克、薛定谔等人的鼓励下转入生物学研究，并最终导致分子生物学这一新的研究领域诞生。而德尔布吕克本人，身体力行全面转入生物学研究。他在埃里斯的建议下，以噬箘体这一当时所知的最简单的生命形式为基础，研究生命的复制过程。1940年，正在研究噬箘体的卢里亚与德尔布吕克在费城相遇，两人一拍即合，成立了噬箘体研究小组，在全世界推广噬箘体研究。他们阐明了一系列涉及噬箘体生长的基础问题，并发现即便微小如细菌和噬箘体这样的生物也同样拥有染色体和基因，由此开创了微生物遗传学。而且卢里亚在赌博用的老虎机的启发下，利用统计学知识，巧妙地设计实验，证明细菌对噬箘体的抵抗能力来自基因的随机突变，而非简单的因接触噬箘体所产生的适应，为解决细菌抗药性的问题指明了一条道路。1969年，他们二人与另一位独立研究噬菌体的赫尔希一起因“发现了病毒的复制机制和基本结构”而荣获诺贝尔生理学或医学奖。
噬箘体虽然是一种非常简单的生命形式，但其与细菌的相互较量中，却存在很多有趣的现象。1952年，卢里亚似乎得到了一种奇怪的噬箘体，它能够感染大肠杆菌并将其杀死，但死亡的细菌却没有释放新生的噬箘体，这让卢里亚百思不得其解。在一次次的重复实验中，有一天他不小心打碎了装有大肠杆菌的试管，于是他到隔壁借来了痢疾杆菌，当被感染的痢疾杆菌释放出了噬菌体的时候，本来期待得到类似结果的卢里亚恍然大悟——他的噬箘体没有任何问题，有问题的是大肠杆菌，看来实验用的大肠杆菌发生了某种奇怪的突变，能够限制噬箘体产生后代，但并不能抵抗噬箘体的入侵。由此他发现了噬箘体与细菌的战争中，还存在限制这一现象。但卢里亚万万没想到的是，对这个现象持续20年的研究，最终开启了基因工程的大门。1984年，卢里亚的自传即用《老虎机与破碎的试管》为名，因为这两件事正是启发他做出一生中最重大的两项贡献的契机。
“无关紧要”的问题
当卢里亚公布他的研究结果后，其他研究噬箘体的科学家进一步发现，这种现象非常普遍。一般而言，在某种菌株中生长良好的噬箘体在感染新菌株时往往表现不佳，不过在新菌株中获得的子代噬箘体似乎经由突变而重获了在新菌株中的生长力。但是，如果将这样的似乎突变了的噬箘体重新感染旧宿主，则获得的子代噬箘体的感染新菌株的能力将再次大幅度下降。这就难以用基因突变来加以解释了，毕竟基因突变是相对罕见的，在没有特定的环境选择下，突变的后代也不大可能在一代之内就占据优势地位。贝塔尼和韦格将此种令人困惑的实验现象，称为宿主所致的限制和修饰现象。然而他们并未真正解释所谓限制和修饰究竟是什么含义，也没有进一步去追寻它发生的机制，几乎所有研究噬菌体的科学家都将之视为一种有趣但似乎没有什么意义的现象而忽略了。直到1960年，阿尔伯对这个令人困惑的现象着迷，以至于他完全偏离了自己本来的研究方向，而将全部身心倾注其中，多年后，阿尔伯回忆说，幸亏他不知道这将使他完全转入另一个陌生的研究方向，否则他可能没有足够的勇气开始。
阿尔伯，1929年6月出生于瑞士，1953年毕业于苏黎士工科大学。在其实验物理学教授谢乐的推荐下，成为日内瓦大学克伦贝格尔所领导的生物物理学实验室的一名助理，负责操作电子显微镜。对阿尔伯来说幸运的是，曾经在日内瓦大学担任实验物理学教授的让?韦格，在一次心脏病发作之后，前往美国加利福尼亚理工学院任教，在那里韦格“皈依”了德尔布吕克开始从事噬箘体研究。但他依然每个暑期都会回到日内瓦大学作数月的访问学者，这正是世界上第一张λ噬箘体的电子显微镜照片出自日内瓦大学的原因。在韦格的带动下，克伦贝格尔的团队很快将兴趣转移到有关噬箘体的研究上，而阿尔伯也加入了由克伦贝格尔和韦格领导的噬箘体研究小组，正是在那里他学到了有关噬箘体和遗传学的知识，事实上他的博士论文正是有关噬箘体突变的研究。从此，阿尔伯和他同时代的许多物理学研究人员一样，转入到生物学研究的新兴领域即分子生物学的研究之中。
1958年，阿尔伯博士毕业，接受了韦格以前的同事——南加利福尼亚大学乔.贝塔尼的邀请，来到美国。阿尔伯在噬箘体研究上的才华，很快被微生物遗传学领域的权威人物所认可，因此他获得了进入当时非常优秀的几个噬箘体实验室作博士后的机会。但是，克伦贝格尔催促他回到日内瓦大学领导有关辐射对微生物DNA的损伤、修复及基因重组方面的研究。几经思索后，1960年，阿尔伯同意回到日内瓦大学，但在此之前，他花费了数周时间，依次拜访了当时噬箘体研究的权威实验室，如加州大学伯克利分校的冈瑟?斯坦特、斯坦福大学的莱德伯格以及麻省理工学院的卢里亚所领导的实验室，收获颇丰。回到日内瓦大学后，阿尔伯开始研究辐射对大肠杆菌的影响，他决定以噬菌体为工具，研究辐射是如何影响大肠杆菌对噬箘体的抗性。这时，阿尔伯的实验也遇到了宿主所致的限制和修饰现象，他很快就明白发生了什么，但他焦虑于不知晓噬箘体是如何被限制又是如何经由所谓的修饰而适应于新宿主的。阿尔伯决心克服这个障碍，那就意味着先要研究清楚它发生的机制。正是对这个研究中所遇到的“无关紧要”的问题的追根究底，让阿尔伯开创了一个新的研究领域，并最终将他引领到1978年的诺贝尔生理学或医学奖的面前。
我们向自然提问，可它的回答充满了谎言
就在阿尔伯转向后不久，1961年，克伦贝格尔的一个博士生在利用放射性DNA做实验时，偶然发现在所谓宿主所致的限制现象中伴随有噬箘体DNA的大量降解，而没有限制现象时则观察不到噬菌体DNA的降解。这个实验极大的启发了阿尔伯，他立刻设计了相应的实验，由此认识到限制和修饰都影响到DNA分子，但是却并不引起DNA分子的突变，而且这种影响不仅限于噬箘体自身的DNA分子也涉及到宿主的DNA分子。这些研究成果，使他获得了1962年的日内瓦大学的一项学术奖励。但如果说限制意味着DNA分子的降解，那么修饰究竟发生了什么，以至于DNA能够维持稳定？
1963年，阿尔伯访问冈瑟.斯坦特所领导的实验室，在那里作了两个月的访问学者，初步发现DNA的甲基化修饰很可能就是宿主修饰和限制的关键所在。在阿尔伯的带动下，一些科学家开始致力于研究宿主的限制和修饰现象。到了1965年的时候，已经有很多证据显示DNA的甲基化修饰的确就是宿主限制和修饰中非常重要的一个环节。至此，笼罩在这个现象上的迷雾已经从理论上被驱散。阿尔伯正式提出细菌的限制－修饰系统的机制，这个系统需要细菌中存在两种功能相互补充的酶，即限制酶和甲基化修饰酶。细菌利用限制酶特异性识别噬菌体DNA分子并在其识别位点中切断它，最终导致噬菌体DNA分子的降解，但细菌自身的DNA分子则通过甲基化修饰酶进行甲基化修饰加以保护，以阻止限制酶的作用。现在的任务则是如何分离纯化获得这两种酶，以验证上述理论的正确性。
1968年，第一个限制酶EcoK被马特.梅索森等人从大肠杆菌K株中分离出来了，同年阿尔伯也从大肠杆菌B株中分离到限制酶EcoB。然而遗憾的是，这两种酶虽然识别DNA序列上特定的位点，但其切断DNA分子时，却具有很大的随机性，通常在远离识别位点几千个碱基的距离上随机切割。这就使得它无法作为基因工程的合适工具。并且此类酶还兼具修饰功能，因为它们的活性依赖一种小分子（s－腺苷甲硫氨酸），而这个小分子正是DNA甲基化的原料。然而梅索森未认识到这个古怪需要的真实意义，并且他过于自信地认为自己找到的酶正是阿尔伯理论中所预言的限制酶，而未及时从实验结果中发现他的酶在切割DNA时的随机性，他深陷在证明EcoK在切断DNA时具有精确性中难以自拔。这真是应了一句名言，我们向自然提问，但它的回答充满了谎言，或者换句话则是自然界的复杂总是出人意料。直到若干年后，在其它科学家的研究下，才认识到EcoK和EcoB的上述特性，这或许就是梅索森错失诺贝尔奖的原因吧。
限制酶，就是它
看生物科学史，难免有时候会产生世事弄人的感慨。与阿尔伯同获1978年诺贝尔奖的史密斯，直到1967年才了解阿尔伯的工作。史密斯生于1931年8月，1952年毕业于约翰.霍普金斯大学医学院，在当了一段时间医生后，他最终转入分子生物学研究领域，研究噬菌体。1962年他获得博士后奖学金资助，进入密歇根州立大学人类遗传学系跟随迈克做有关噬菌体P22的研究。1967年，迈克利用年假，访问了阿尔伯的实验室。史密斯通过与迈克的书信往来，第一次了解到阿尔伯的限制－修饰理论，同年他接受了霍普金斯大学微生物学系助理教授的聘任，进入了纳森斯所领导的实验室。
1968年梅索森的论文发表后，史密斯很感兴趣，但他并未开始立即着手研究此类现象。其时他正和助手研究有关流感嗜血杆菌的遗传重组问题，在一次实验中，史密斯将他从前研究过的噬菌体P22的DNA加入到嗜血杆菌的提取液中，他们发现DNA消失了！这个现象立刻让他联想到刚看过不久的梅索森的论文，以及阿尔伯的理论。史密斯紧紧抓住这个现象不放，持续研究了两年时间，到1970年，他已经做了大量工作，证明他所发现的酶HindⅡ具有精确的切割位点，并发现了它的识别顺序，研究结论异常有力。虽然此时他尚未发现相应的甲基化修饰酶，但他毫不犹豫的将他所发现的酶称为限制酶。
1969年，正在以色列魏兹曼科学研究院学习有关哺乳动物的致瘤病毒的纳森斯收到了史密斯的来信，信中史密斯汇报了对HindⅡ的研究工作。收到信后，纳森斯灵机一动，想到可以利用这类酶来研究病毒的DNA序列。当他回到霍普金斯后，纳森斯以SV40这个最简单的动物致瘤病毒为基础，制作了第一张限制酶切图谱。而他的学生和同事则在此基础上，做了很多其它研究，比如分析基因组的变异，制造突变等。当相关研究发表后，生物医学的研究者们立刻认识到这种酶对DNA研究的重要性，由此掀起了一股持续至今的寻找新的限制性酶以及利用这类酶进行研究的热潮，而纳森斯亦当之无愧成为1978年获奖者中的一员。
关于限制性酶的故事或许已经结束，但关于修饰的故事似乎才刚刚开始。虽然DNA甲基化修饰现象最初发现于细菌中，但后来科学家们发现在真核生物中也存在广泛的DNA甲基化修饰现象。就哺乳动物而言，DNA的甲基化修饰和X染色体失活、胚胎发育、组织分化乃至癌症密切相关。对细菌而言，进行甲基化修饰是为了避免被限制酶所切割，但对真核生物而言，修饰则影响基因表达。大多数情况下，甲基化修饰导致基因表达沉默。并且这种修饰在细胞有丝分裂时可以代代传递，以至于已经有一个新的遗传学分枝——表观遗传学致力于研究它的奥妙。而相应的人类表观基因组计划也于2003年启动，预计2008年结束。相信到那时，这个有关限制和修饰的故事，将会再次带给人们新的洞见和惊喜。
小链接 人类表观基因组计划
经典遗传理论认为，生命的信息都在基因组DNA的排列顺序当中。但当前越来越多的证据表明，即使在基因组序列完全一致的情况下，DNA的甲基化程度不同，其表现出来的性状也会有差异。这些表观遗传修饰不仅影响着个体的发育与生长，而且还可以在不改变DNA序列的情况下遗传给下一代。科学家正在以一种全新的视野来理解生命现象。表观遗传学就是在这种情况下提出来，研究基于非基因序列改变（如甲基化和染色质构象变化等）所致基因表达水平变化的一门学科。表观遗传学使人们对基因组的认识又增加了一个新视点：对基因组而言，不仅仅是序列包含遗传信息，其修饰也可以记载遗传信息。这种在基因组的水平上研究表观遗传修饰的领域被称为“表观基因组学”。1999年欧洲的生物学家成立了 “人类表观基因组协会”，并于2003年宣布正式启动为期五年的人类表观基因组计划。人类表观基因组计划的实施标志着人类表观基因组学研究又跨上了一个新台阶。
（本文转载自健康中国人网）
